Активность - фосфодиэстераза
Cтраница 1
Активность фосфодиэстеразы с низкой Кт при добавлении протекторов in vitro изменялась незначительно. Добавление в концентрации ( 5 - 10 - 4 М) серотонина, гистамина и дофамина к грубой мембранной фракции тканей крыс приводило к активации аденилатциклазы. [1]
Измеряют активность фосфодиэстеразы в присутствии Са2 и кальмодулина на профиле элюции фермента при повторной хроматографии на ДЭАЭ-ТСК. Фракцию с максимальной активностью отбирают для дальнейшего использования в экспериментах. Хранят при температуре 4 С. [2]
 |
Содержание ( в п / моль на 1 мг белка цАМФ и цГМФ в отделах мозга нормальных и облученных крыс. [3] |
Так, имидазол ( 40 мМ) повышает активность фосфодиэстеразы с низкой Кт на 28 % у контрольных и на 72 % у облученных ( через 24ч) животных. Теофиляин ( 1 - 10 - 3 М), тиопентал ( 1 - 10 - 6 - 1 - 10 - 3 М) и кофеин ( 5 - 10 - 4 - 1 - Ю 2 М) в значительно большей степени ингибируют фосфодиэстеразу ( с низкой Кт) у крыс, подвергнутых действию радиации. Эти результаты могут объяснить причины изменения действия некоторых лекарственных веществ в облученном организме. Например, показано, что кофеин ( 50 и 80 мг / кг) сокращает длительность плавания нормальных крыс, но увеличивает ее у облученных особей. Эти данные объяснимы, если учесть повышенную чувствительность фосфодиэстеразы мозга в пострадиационный период к действию кофеина [ Петков В. [4]
При тотальном облучении крыс в дозе 190 мКл / кг активность фосфодиэстеразы цАМФ с высокой Кт ( 1 - 10 - 4 М) He-изменяется в течение 7 сут. В то же время активность фосфодиэстеразы с низкой Кт ( 1 - 10 - 6 М) была снижена через 24 ч на 40 %, а к 7 - м суткам возвращалась к исходному уровню. Следует напомнить, что компартментализация действия цАМФ в клетке регулируется фосфодиэстеразой с высокой и низкой Кт. Таким образом, при угнетении фосфодиэстеразы с низкой Кт могут увеличиться локальная концентрация цАМФ и активироваться цАМФ - зависимое фосфорилирова-ние мембранных белков. К сожалению, активность аденилатциклазы головного мозга при облучении в минимально летальных дозах не исследована, и судить о постоянной концентрации цАМФ в ткани трудно. [5]
Исследуют влияние трифторпиразина и его синтетического аналога W - 7 на активность фосфодиэстеразы. [6]
Однако добавление к этой системе ионов Са2 приводит к значительному повышению активности фосфодиэстеразы. [7]
У мышей, облученных в дозе 8 5 Гр, изменений активности фосфодиэстеразы цАМФ в скелетных мышцах не обнаружено во все сроки наблюдения. У кроликов, подвергнутых дей-ствию ионизирующей радиации в дозе 10 Гр, отмечена активация этого фермента в супернатанте после центрифугирования при 105 000 g ( фосфодиэстеразной активности в мембранной фракции не выявлено) на 65 % через 1 ч, в последующие сроки активность фермента незначительно превышала исходный уровень. При тех же акспериментальных условиях в растворимой фракции миокарда активность фосфодиэстеразы цАМФ была снижена через 1 ч ( на 20 %), 5 сут ( на 43 %) и 7 сут ( на 19 %) после облучения. Мембранно-связанная фосфодиэстераза цАМФ оказалась более радиорезистент-ной: существенных изменений ее активности в пострадиационный период не обнаружено. [8]
Предполагают, что стимулирующее действие радиации на способность аденилатциклазы активироваться под действием изопротеренола связано с угнетением активности фосфодиэстеразы с низкой Кш через 24 ч после облучения. В экспериментах по облучению изолированных плазматических мембран печени выявлена довольно высокая устойчивость аденилатциклазы к действию ионизирующей радиации. [9]
Причиной отмеченных изменений является стимуляция гуанилатциклазы ( в 1 7 раза через 30 мин, в 2 4 раза через 60 мин), а активность фосфодиэстеразы цГМФ только через 1 ч после облучения на 50 % превышает исходный уровень. [10]
Параллельно измерялась активность двух ферментов во всех фракциях. Активность фосфодиэстеразы змеиного яда, катализирующей отщепление 3 -концевых нуклеотидов от нуклеиновых кислот, определялась по количеству окрашенного в желтый цвет я-нитрофенолята, отщепившегося от Са-бис и-нитро-фенилфосфата, который является субстратом фосфодиэстеразы. [11]
При тотальном облучении крыс в дозе 190 мКл / кг активность фосфодиэстеразы цАМФ с высокой Кт ( 1 - 10 - 4 М) He-изменяется в течение 7 сут. В то же время активность фосфодиэстеразы с низкой Кт ( 1 - 10 - 6 М) была снижена через 24 ч на 40 %, а к 7 - м суткам возвращалась к исходному уровню. Следует напомнить, что компартментализация действия цАМФ в клетке регулируется фосфодиэстеразой с высокой и низкой Кт. Таким образом, при угнетении фосфодиэстеразы с низкой Кт могут увеличиться локальная концентрация цАМФ и активироваться цАМФ - зависимое фосфорилирова-ние мембранных белков. К сожалению, активность аденилатциклазы головного мозга при облучении в минимально летальных дозах не исследована, и судить о постоянной концентрации цАМФ в ткани трудно. [12]
Однако при гидролизе фосфо-диэстеразой сАМР разрушается. Эти наблюдения указывают на то, что активность фосфодиэстеразы стимулируется ионами Са2, действие которых опосредовано кальмодулином. Это согласуется с известным фактом, что кальмодулин представляет собой Са2 - связывающий белок. [13]
Реакцию проводят в инкубационной среде, состоящей из 50 мМ трис - HCl ( рН 7 0), 10 мМ ацетата магния, цАМФ как субстрата реакции ( концентрацию цАМФ выбирают в зависимости от целей эксперимента) и 0 3 - 0 4 мкКи ( 3Н) - цАМФ для определения скорости реакции по изменению концентрации радиоактивного изотопа в пробе. Дополнительно в соответствии с поставленной задачей инкубационная среда может содержать ЭГТА для определения активности фосфодиэстеразы; свободной от кальмодулина или Са2 и кальмодулина для активации фермента, различные комбинации концентрации Са2, кальмодулина и его антагонистов для определения действия последних на комплексе Са2 - КМ-ФДЭ. [14]
У мышей, облученных в дозе 8 5 Гр, изменений активности фосфодиэстеразы цАМФ в скелетных мышцах не обнаружено во все сроки наблюдения. У кроликов, подвергнутых дей-ствию ионизирующей радиации в дозе 10 Гр, отмечена активация этого фермента в супернатанте после центрифугирования при 105 000 g ( фосфодиэстеразной активности в мембранной фракции не выявлено) на 65 % через 1 ч, в последующие сроки активность фермента незначительно превышала исходный уровень. При тех же акспериментальных условиях в растворимой фракции миокарда активность фосфодиэстеразы цАМФ была снижена через 1 ч ( на 20 %), 5 сут ( на 43 %) и 7 сут ( на 19 %) после облучения. Мембранно-связанная фосфодиэстераза цАМФ оказалась более радиорезистент-ной: существенных изменений ее активности в пострадиационный период не обнаружено. [15]
Страницы: 1 2