Равновесное центрифугирование

Cтраница 1

Равновесное центрифугирование в градиенте плотности, впервые предложенное Мегельсопом и др. [1], является одним из наиболее ценных методов фракционирования и характеристики ДНК. Для этого обычно используют две соли цезия - CsCl и CssSCU. Градиенты плотности растворов этих солей несколько отличаются по своим свойствам. Однако содержание гуанина и цитозина ( Г Ц) в ДНК удобнее определять с помощью градиента плотности CsCl, поскольку в этом случае плавучая плотность ДНК практически линейно зависит от процентного содержания в ней ГЦ-нар ( в пределах 20 - 80 %, см. фиг. Тем не менее содержание Г Ц в неизвестном препарате ДНК иногда бывает полезно определить в градиентах плотности обеих солей. Если при этом результаты расходятся ( фиг. ДНК имеются минорные основания. [1]

При определении молекулярных масс в ультрацентрифуге [ 67 - 69 различают метод измерения скорости седиментации и равновесное центрифугирование. В то время как в первом случае измеряют скорость седиментации, во втором - определяют положение седимеитационного равновесия. [2]

Использование N14 - N15 биологической гибридной ДНК ( в которой N15 мечена только одна из цепей) в сочетании с равновесным центрифугированием в градиенте плотности показало, что кинетика разделения этой ДНК на две одноцепочечные субъединицы ( которую можно было измерить по исчезновению гибридной полосы или по появлению полос однотяжных структур, причем каждый компонент обладал характеристической плотностью) находится в соответствии с рассчитанной [311] скоростью расплетания двойной спирали со сравнимой длиной цепей, внутри которой отсутствуют связи, удерживающие эти цепи вместе. При 100 в 0 15 М растворе хлористого натрия, содержащем 0 015 М цитрата натрия, разделение цепей ДНК заканчивается за 60 сек. [3]

Метод центрифугирования в градиенте плотности имеет две разновидности: метод, основанный на измерении скорости седиментации в градиенте сахарозы, и метод равновесного центрифугирования, в котором используется градиент хлористого цезия. В первом варианте используется заранее приготовленный градиент, а во втором - градиент создается под действием поля центробежных сил непосредственно в ходе эксперимента. [4]

Так как разборка сопровождается увеличением отношения РНК: белок в частицах, то за ее ходом удобно следить по увеличению плавучей плотности частиц, например, методом изопикнического равновесного центрифугирования в градиенте концентрации CsCl. Отщепление этих последних белков требует уже применения более жестких воздействий, таких как комбинация высокой соли с мочевиной. [5]

Для выделения ДНК из хлоропластов 88 - 90 используют тот же самый прием, что и при выделении митохондриальной ДНК, - обработку субклеточных частиц ДНК-азой перед их разрушением. В этом случае, однако, не удается добиться полного удаления ядерной ДНК, и ДНК хлоропластов очищают далее равновесным центрифугированием в градиенте плотности CsCl. Наиболее подробному исследованию подвергалась ДНК из хлоропластов зеленой водоросли Euglena gracilis 91; она отличается от ДНК ядра по составу оснований и существует в виде двухцепочечного комплекса с мол. [6]

Для одновременного проведения сразу нескольких опытов служат роторы с несколькими ячейками. Используя в ячейках клиновидные кварцевые стекла; можно получить одновременно несколько различных интерференционных картин выше и ниже обычного положения, как показано на фиг. Длительное равновесное центрифугирование в таком роторе с применением оптики Рэлея эквивалентно пяти отдельным опытам с обычным ротором. При работе с такими ячейками, однако, фазовую пластинку необходимо убрать и после этого вновь сфокусировать изображение объективом. [7]

Определение содержания ДНК на одну вирусную частицу показывает, что обычно в состав частицы входит либо одна молекула ДНК, либо один двухцепочечный комплекс. Естественно поэтому ожидать, что препараты ДНК, выделенные из вирусов, будут индивидуальными в химическом смысле молекулами ДНК или по крайней мере комплексами из двух индивидуальных молекул. Это предположение оправдывается во многих случаях, причем иногда удается после разрушения двухцепочечного комплекса разделить с помощью равновесного центрифугирования индивидуальные по-линуклеотидные цепи. [8]

Схема, иллю. [9]

В равновесном варнаше градиентного метода низкомолекулярное растворенное вещество и макромолекулы перед центрифугированием распределены равномерно по всему раствору. Чтобы получить раствор с высокой плотностью и низкой вязкостью, используют такие неорганические соли, как CsCl, Cs2SO4 и NaBr. Интерес к солевым градиентам особенно возрос после блестящих работ Меселсона, Сталя и Винограда [16, 17], в которых метод равновесного центрифугирования был использован для разделения ДНК. Поскольку градиент создается в ходе центрифугирования, в данном случае эксперимент продолжается значительно дольше, чем в варианте с предварительно приготовленным градиентом; для сокращения времени, затрачиваемого на установление равновесия, используют метод кратковременных ускорений вращения. [10]

Можно ожидать, что белок с двумя специфическими центрами и двумя идентичными углеводными цепями построен из двух субъединиц. Для выяснения этого было поставлено множество экспериментов в ряде лабораторий. Джеппсон [52] сообщил, что восстановленный алкилированный трансферрин после высушивания и повторного растворения диссоциирует на субъединицы с молекулярной массой 39000 - 42000, как было определено методом равновесного центрифугирования. Исследование восстановленного алкилированного трансферрина независимо в лабораториях Безкоровайного [53] и Фини [54] не подтвердили диссоциацию на субъединицы. Впоследствии Безкоровайный [55] при изучении восстановленного алкилированного и сульфитолизированного трансферрина и кональбумина вновь не получил данных, свидетельствующих о субъединичной структуре этих соединений. Если бы субъединицы действительно существовали, они должны были бы соединяться необычными и еще неизвестными связями. [11]

Одно из них - так называемая температура плавления Тт - это температура, при которой происходит распад двухцепочечного комплекса на одноцепочечные молекулы; этот процесс легко наблюдать по изменению УФ-поглощения или оптического вращения раствора ( подробнее см. в гл. Такое центрифугирование проводят обычно в растворах солей, обладающих высокой плотностью; чаще всего применяют хлорид или сульфат цезия. При длительном центрифугировании устанавливается градиент плотности раствора, а ДНК собирается в узкой зоне, где существует равновесие между центробежной силой и выталкивающей силой, которая определяется разностью плотности осаждаемого вещества и применяемого солевого раствора в данной зоне. Равновесное центрифугирование в градиенте плотности Cs C1 может служить не только аналитическим методом для характеристики препарата ДНК, но и полезным препаративным методом для разделения ДНК, различающихся по нуклеотидному составу. Подобным же образом препаративное ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы используется для разделения молекул ДНК, различающихся по скорости седиментации. [12]

Отсюда следует, что в растворе с отношением 3 3 приблизительно ( 3 3 - 2 0) / 3 3 или же 39 % от всего кремнезема будет представлять собой полимерную форму, тогда как 61 % составляет главным образом мономер. Если степень полимеризации высокомолекулярной фракции составляет - 15, то тогда усредненные по числу и по массе1 молекулярные массы будут, по расчетам, равны 180 и 284 соответственно. Эти значения имеют по крайней мере тот же самый порядок величины, что и среднечисленная молекулярная масса, равная 280, определенная криоскопическим методом [63], и усредненная по массе молекулярная масса, равная 325, определенная Дебаем и Нойманом [37] методом рассеяния света. Значение молекулярной массы 900, полученное Эвестоном [31] методом равновесного центрифугирования, оказалось выше, вероятно, из-за того, что автор измерял молекулярную массу в растворах хлорида натрия. Экстраполяция его данных к значению наименьшей концентрации соли ( 0 08 М) дает основание полагать, что молекулярная масса для данного отношения Si02: Na20 равна - 600; в отсутствие соли молекулярная масса была бы еще ниже. [13]

Молекулярный вес образца может быть определен по одновременному измерению скорости седиментации в очень больших полях центробежной силы и коэффициента диффузии полимера в растворе. Ультрацентрифугирование нашло широкое применение при определении молекулярных весов таких компактных макромолекул, какими являются белки. Для статистических клубков применение метода скоростной седиментации осложняется тем, что при конечной концентрации раствора макромолекулы, перекры-ваясь, оказывают взаимное влияние друг на друга при седиментации. Это затрудняет интерпретацию экспериментальных данных. Средневесовой молекулярный вес полимеров, макромолекулы которых представляют собой статистические клубки, обычно определяют методами равновесного центрифугирования или методом Арчибальда. Однако для определения молекулярных весов кристаллических полиолефинов метод ультрацентрифугирования не применялся; быстрый и удобный метод скоростной седиментации с успехом может быть применен для оценки молекулярно-весо-вого распределения полиолефинов. [14]

Используя соответствующую соль, можно создать устойчивый в условиях центрифугирования градиент ее концентрации, а тем самым и градиент плотности растворителя. Наиболее широкое применение для этой цели нашли растворы солей цезия, которые позволяют получить растворы с плотностью, достаточной для остановки перемещения нуклеиновых кислот. Эксперименты подобного рода весьма дороги, так как требуют длительной, обычно на протяжении нескольких суток, работы ультрацентрифуг. Однако они открывают некоторые уникальные возможности. Например, удается разделить биополимеры, различающиеся лишь изотопным составом. Молекулы ДНК из одного вида микроорганизма, выращенные на средах, содержащих в качестве источника азота соли аммония 14NH4 и 15NH4, не отличаются по объему, но имеют разные массы и, следовательно, различные плавучие плотности. Поэтому при равновесном центрифугировании и градиенте плотности хлорида цезия они образуют отдельные зоны. [15]

Страницы: 1