Cтраница 1
Натрий-фосфатный буфер - 0 1 М раствор, рН 7 6, содержащий 10 мМ ЭДТА и 1 мМ дитиотреитол. [1]
Заливают 15 объемами исходного буферного раствора ( 0 01 М натрий-фосфатный буфер, рН 6 0) и доводят рН полученной суспензии до 6 0 Используют колонку размером 1 5X20 см. Уравновешивание ионита осуществляют тем же буфером. [2]
Препарат рибонуклеазы ( 15 мг) растворяют в 2 мл исходного буферного раствора и наносят на колонку. Элюцию белка проводят натрий-фосфатным буфером с использованием линейного градиента ( с. Наиболее прочно сорбированные фракции элюируют 1 М NaCl. Элюат собирают порциями по 3 - 4 мл. Содержание белка определяют при 230 нм. [3]
В методе Вебера и Осборн буферные растворы для приготовления геля и электродный не отличаются между собой. Обычно используют О 1 или 0 05 М натрий-фосфатный буфер. Кроме того, используют два типа гелей - концентрирующий и разделяющий. Эти модификации приводят к тому, что на границе между концентрирующим и разделяющим гелем весь белковый образец собирается в виде узкого диска. Это способствует более четкому разделению белков. [4]
В качестве примера здесь описано приготовление колонки, содержащей 30 мл суспензии МАК. В хроматографическую колонку с внутренним диаметром 30 мм сначала помещают бумажный порошок и затем добавляют примерно 20 мл 0 1 М раствора забуференной соли. Для того чтобы жидкость не вытекала из колонки, ее нижнюю часть перед добавлением жидкости закрывают пробкой. Смесь тщательно суспендируют стеклянной палочкой и пробку вынимают; после вытекания жидкости на дне колонки образуется ровный слой ( 2 - 4 мм) бумажного порошка. Затем колонку вновь закрывают снизу пробкой и пипеткой с большим выходным отверстием на слой целлюлозы медленно наливают 30 мл суспензии МАК. После этого пробку вынимают и МАК уплотняют в колонке под давлением воздуха. Для того чтобы колонка не подсохла, подачу воздуха прекращают в тот момент, когда над слоем МАК почти не останется буферного раствора. Затем на слой МАК наливают прокипяченную суспензию 2 г кизельгура в 0 05 М натрий-фосфатном буфере и уплотняют ее точно так же. Слой кизельгура предохраняет слой МАК от повреждений. Обычно колонки промывают забуференным 0 4 М NaCl, а при фракционировании ДНК с небольшим молекулярным БССОМ для промывки используют ОД М раствор забуференной соли. Концентрацию образца нуклеиновой кислоты в стандартном солевом растворе ( 0 15 М NaCl 0 015 М цитрат натрия) доводят примерно до 20 - 100 мкг / мл; этот раствор осторожно наносят на колонку, стараясь не нарушить поверхностный слой, и пропускают его через колонку под давлением воздуха со скоростью примерно 3 мл / мин. Для определения степени адсорбции образца на колонке пропущенную через колонку жидкость собирают и измеряют ее поглощение в УФ-свете. После нанесения образца колонку зшовь промывают 40 мл исходного забуференного солевого раствора. [5]
В этот сосуд одновременно с помощью двух перистальтических насосов приливают по 0 5 л 0 5 М раствор СаС12 и 0 5 М раствор Na2HPO4 со скоростью 0 5 - 0 6 мл / мин. При этом смесь тщательно и осторожно перемешивают механической мешалкой. Образовавшийся осадок после 30-минутного выстаивания промывают 4 раза водой, каждый раз удаляя избыток жидкости декантацией. Затем промытый осадок суспендируют в 1 л воды и к суспензии добавляют 25 мл 40 % - ного раствора NaOH. Смесь нагревают на кипящей водяной бане до 96 - 98 С и выдерживают при этой температуре в течение часа. Чтобы избежать местного перегрева и разрушения кристаллов геля, смесь во время нагревания периодически осторожно перемешивают вручную. После нагревания осадку дают отстояться, жидкость над осадком, не дожидаясь ее охлаждения, декантируют, а осадок промывают ( 4 - 5 и более раз) дистиллированной водой ( по 1 л) до достижения нейтральной реакции среды в промывных водах. Время осаждения кристаллов при этом 10 мин. Промытый осадок суспендируют в литре 0 01 М натрий-фосфатного буферного раствора ( рН 6 8) и нагревают на кипящей водяной бане до 96 - 98 С. Жидкость над осадком декантируют, а к осадку приливают новую порцию ( 1л) буфера и полученную смесь инкубируют в течение 5 мин при 96 - 98 С. Снова заменяют новой порцией этого же буфера и нагревают полученную суспензию в тех же условиях еще 15 мин. Полученный гидроксилапатит осторожно суспендируют в 0 01 М растворе натрий-фосфатного буфера ( рН 6 8) и через 10 мин жидкость над гелем декантируют. [6]