Среда - инкубация
Cтраница 1
Среда инкубации: 0 5 М КС1, 0 02 - 0 04 мМ трис - НС1, 1 - 2Х ХЮ-2 М СаС12, 5 - 7 мг / мл АТФ, рН среды инкубации доводится до 7 6 после смешивания всех компонентов. [1]
 |
Участие экзогенного убихинона в переносе восстановительных эквивалентов из обработанных антимицином А митохондрий в дыхательную цепь СМЧ. [2] |
Среда инкубации, содержащая: 0 15 М сахарозу, 75 мМ КС1, 5 мМ фосфат калия, 2 5 мМ MgCl2, 0 2 мМ ЭДТА, 0 5 мг / мл БСА, освобожденного от жирных кислот. [3]
Среда инкубации, содержащая 0 15 М сахарозу: 75 мМ КС1; 5 мМ фосфат калия ( рН 7 4); 2 5 мМ MgCl2 и 5 мкМ ротенона. [4]
Проба содержит среду инкубации № 1 и 0 3 мл 0 6 М раствора NhUCNS. В течение 2 мин после добавления митохондрий регистрируют величину оптической плотности, затем в кювету с помощью микропипетки приливают 2 4-динитрофенол в конечной концентрации 15 мкМ и в течение 3 мин регистрируют оптическую плотность. Убеждаются в том, что падение оптической плотности увеличивается с увеличением концентрации 2 4-динитрофенола. [5]
Проба содержит среду инкубации № 2 и 0 3 мл 0 6 М раствора цитрата аммония. Регистрируют оптическую плотность в течение 2 мин после добавления митохондрий, затем добавляют 2 мМ ( МН НРС и еще через 2 мин - 2 мМ малата аммония. [6]
Перед определением активности готовится среда инкубации и делается необходимое разведение протеинкиназы. Разведение фермента проводят в отдельных пробах так, чтобы в 20 мкл раствора содержалось по 10, 20, 30, 40, 50 мкг белка соответственно. Среду инкубации раскапывают по 95 мкл в инкубационные пробирки. [7]
Перед определением активности готовят среду инкубации и делают соответствующие разведения фермента. Фермент разводят таким образом, чтобы в 20 мкл раствора было по 2, 3, 5, 7, 10 мкг белка соответственно. Фильтры нумеруют, надписывая их простым карандашом. [8]
В-четвертых, присутствие в среде инкубации соединений, необходимых для полноценной работы сопрягающей системы ( субстрат, кофакторы, активаторы), может существенно сказаться на скорости изучаемой реакции. Чтобы исключить такую возможность, проводят предварительные эксперименты, где процессы образования продукта реакции и его определения разобщены. С этой целью применяют метод отбора проб: проводят изучаемую реакцию в отсутствие компонентов сопрягающей системы, останавливают реакцию, и накопившийся продукт реакции определяют количественно уже с помощью сопрягающей системы. [9]
В полярографическую ячейку помещают 2 мл среды инкубации и погружают в нее электроды полярографа. Спустя 1 мин в ячейку добавляют раствор СаС12 в конечной концентрации 3 - 4 - 10 - 4 М4 и регистрируют обратимую стимуляцию дыхания. [10]
В кювету полярографа помещают 2 мл среды инкубации, погружают электроды и устанавливают положение пера самописца в исходное положение шкалы. Регистрируют постоянную скорость дыхания и через 40 - 60 с добавляют 200 мкМ АДФ. После последовательного изменения скоростей дыхания ( переход V - Vs - V) через 1 - 2 мин добавляют 100 мкМ 2 4-динитрофенол. Регистрируют убыль кислорода в кювете до наступления анаэробиоза. [11]
Для определения АТФазной активности к 1 мл среды инкубации добавляется 0 1 мл раствора миозина в 0 5 М КС1, содержащего около-10 мг белка в 1 мл. [12]
В полярографическую кювету, содержащую 2 мл среды инкубации, погружают электроды, вносят 50 мкл суспензии обработанных анти-мицином митохондрий, добавляют 5 мМ малат и 5 мМ глутамат и через 1 - 2 мин вносят 50 мкл густой ( 50 - 70 мг / мл) суспензии препарата Кейлина-Хартри. Внесение субмитохондриальных фрагментов практически не вызывает стимуляции поглощения кислорода. По ходу реакции добавляют 100 мкМ динитрофенол и регистрируют увеличение скорости поглощения кислорода. Убеждаются в полной чувствительности наблюдаемой убихинон-редуктазной активности ( измеренной с различными гомологами убихинона) к ротенону. С этой целью в кювету по ходу реакции вносят 5 мкМ ротенон и наблюдают полное ингибирование реакции. [13]
В инкубационные пробирки раскапывают по 50 мкл среды инкубации и помещают их в термостат на 30 С Реакцию начинают добавлением 20 мкл соответствующих растворов протеинкиназы. [14]
Определяют целостность эритроцитарной мембраны по выходу гемоглобина в среду инкубации. Устойчивость мембраны может оцениваться по спонтанному гемолизу, а также при действии разнообразных факторов физической ( температура, встряхивание, излучение) и химической ( кислоты, щелочи, соли и др.) природы. [15]
Страницы: 1 2 3 4