Cтраница 2
В опытах с ДНК млекопитающих, довольно гетерогенной по природе, такую рекомбинацию осуществить нелегко. Это нетрудно проделать с гомогенными препаратами бактериальной ДНК, причем можно показать, что рекомбинация цепей сопровождается восстановлением биологической активности данной ДНК. Так, при нагревании ДНК пневмококка, обладающей трансформирующей активностью, эта активность теряется, но она в значительной мере восстанавливается при медленном охлаждении. [16]
Последняя величина находится в хорошем согласии с средним размером цистрона, вычисленным из данных по генетическим картам. Следовательно, размер минимальной области молекулы ДНК, несущей трансформирующую активность, есть не что иное, как один цистрон. [17]
ДНК снижается на 36 %, но при этом сохраняется 46 % исходной трансформирующей активности. Если же гидролизующим ферментом служит эндонуклеаза ( ДНК-аза I), то уменьшение вязкости ДНК на 36 % сопровождается резким снижением трансформирующей активности до 0 1 % первоначальной величины в результате распада цепи в критических участках. [18]
Дезоксирибонуклеат натрия сам по себе растворим в форм-амиде и диметилсульфоксиде [261, 280], однако ни одно из этих веществ не может быть использовано в качестве растворителя. Дело в том, что растворение ДНК ( или РНК) в формамиде или диметилсульфоксиде приводит к ее денатурации. Денатурация ДНК из пневмококков формамидом при данной ионной силе и температуре происходит при критической концентрации ( около 60 % по объему) формамида и сопровождается потерей трансформирующей активности. [19]
Вероятно, ДНК каждого организма или вида различаются в биологическом отношении. Такие посторонние ( гетерогенные) ДНК способны, однако, проникать в пневмококки; не вызывая заметных изменений в свойствах клетки, они могут воспрепятствовать проявлению трансформирующей активности той ДНК, которая в обычных условиях вызывает трансформацию. Другими словами, гетерогенные ДНК действуют в некоторых отношениях как конкурентные ингибиторы; будучи достаточно схожими с пневмококковой ДНК. [20]
Хотя полученные индивидуальные фракции нельзя считать полностью гомогенными ( ввиду природы дезоксири-бонуклеиновых кислот маловероятно, что этого можно достичь применением какого-либо одного метода), метод является высокоэффективным. Значительной деструкции биологически активных дезоксирибонуклеиновых кислот при адсорбции и элюировании с ЭКТЕОЛА не наблюдается; так, была достигнута значительная степень фракционирования трансформирующей ДНК из пневмококка. Представляет интерес то наблюдение, что многие различные фракции обнаруживают один и тот же характер биологической активности, хотя количественно они различаются. Достигнуто также частичное разделение различных трансформирующих активностей. Как и следовало ожидать, на хроматографические профили элюирования сильное влияние оказывает метод выделения. Исследование относительного содержания пуринов и пирими-динов в различных фракциях препаратов дезоксинуклеиновой кислоты из тимуса теленка обнаружило широкие вариации в соотношении оснований. В частности, хотя отношение пуринов к пиримиди-нам всегда было близко к единице, отношения аденина к тимину и гуанина к цитозину значительно отличались от часто получаемого значения 1 0, которое вытекает из комплементарности специфических оснований в двуспиральной вторичной структуре дезоксирибонуклеиновой кислоты. [21]
Хотя спираль нативной молекулы ДНК имеет более 103 внт-ков, расчет показывает, что раскручивание спирали происходит всего лишь за несколько секунд. В опытах с ренатурацией ДНК охлаждение раствора длится час и более, и, следовательно, процесс ренатурации можно считать равновесным во всей области изменения температуры. Для восстановления двойных спиралей при медленном охлаждении требуется, чтобы вновь соединились цепи, комплементарные друг другу. В растворе гетерогенной ДНК могут также встретиться и соединиться друг с другом и некомплементарные цепи, но из-за несоответствия их нуклеотидного состава константа равновесия для таких агрегатов будет значительно меньше, чем для двойной спирали, образованной комплементарными цепями. Поэтому преимущественно должно происходить специфическое образование двойных спиралей из комплементарных цепей. Это подтверждают и эксперименты по трансформации. Оптимальная температура для восстановления трансформирующей активности примерно на 25 ниже температуры перехода нативной ДНК бактерий. [22]