Cтраница 4
ДНК-полимераза удлиняет эту цепь РНК, используя для синтеза ре-лликационных фрагментов дезоксирибонуклеозидтрифосфаты. В дальнейшем затравочные РНК-концы отщепляются. Бреши в синтезированной цепи заполняются за счет дальнейшей работы полимеразы, а надрезы сшиваются под действием лигазы. Согласно этому механизму, одна цепь может синтезироваться непрерывно по всей длине, а другая должна образовываться дискретно, присоединег нием репликационных фрагментов. Однако у некоторых организмов обе цепи могут синтезироваться дискретно. [46]
Полимераза ДНК - это энзим копирования и передвижения; он медленно передвигается вдоль коротких цепочек ДНК, воспроизводя их дополнения методом, похожим на типогенетиче-ский. Для этого он пользуется материалом-сырцом - а именно, нуклеотида-ми, плавающими вокруг в цитоплазме. Поскольку это действие происходит скачкообразно ( каждый скачок - это сначала растаскивание цепочек и затем их воспроизводство), возникают короткие паузы, заполняемые при помощи лигазы ДНК. Этот процесс повторяется снова и снова. Этот отлаженный трехэнзимный аппарат передвигается аккуратно по всей длине молекулы ДНК, пока ее цепочки не окажутся полностью разделенными и скопированными. В результате получаются две копии первоначальной ДНК. [47]
В сложных и разнообразных клеточных процессах обмена веществ участвуют многие биокатализаторы - ферменты, которые являются веществами белковой природы. Деятельность как отдельных клеточных структурных элементов, так и всей клетки в целом происходит лишь при участии ферментов. Следовательно, все биохимические процессы в клетке являются ферментативными. В соответствии с характером катализируемых реакций ферменты разделяются на шесть основных групп: оксидоредук-тазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы и лигазы. [48]
ДНК-лигазы - ферменты, катализирующие репарацию одноцепочечного разрыва, который обычно возникает под влиянием эндонуклеаз. Поэтому ДНК-лигазы называют еще и сшивающими ферментами. Лигазы обнаружены в самых различных клетках, в том числе и в клетках, зараженных вирусами. Под влиянием этих ферментов образуются фосфодиэфирные связи между свободным 5 -фосфатным концом олиго - или полинуклеотида и З - гидроксильной группой соседнего олиго - или полинуклеотида. Скорее всего реакция протекает с обязательным образованием промежуточного комплекса лигазы с АМФ. Например, в клетках кишечной палочки такой комплекс образуется при взаимодействии лигазы с НАД, а в клетках млекопитающих такой комплекс образуется при взаимодействии лигазы с АТФ. [49]
В зависимости от типа химических реакций, подвергающихся каталитическому воздействию, выделяют следующие классы ферментов: 1) гидролазы, ускоряющие процессы разложения или синтеза, проходящие с участием воды. Так, липаза ускоряет гидролиз жиров, сопровождающийся образованием глицерина и высших жирных кислот; 2) оксиредуктазы катализируют окислительно-восстановительные реакции. Ферменты, участвующие в переносе атомов водорода от одних соединений к другим, называются дегидро-геназами; 3) трансферазы ускоряют реакции передачи атомных групп, радикалов от одних соединений к другим. Они играют важную роль при освобождении энергии фосфатных связей; 4) лиазы катализируют процессы распада, а иногда и синтеза органических соединений. К этому классу, в частности, относятся ферменты, вызывающие разложение аминокислот с образованием аммиака ( дезаминирование); 5) лигазы ( син-тетазы) определяют возможность синтеза сложных соединений из простых. Ферменты этого класса играют важную роль в процессах биосинтеза белков. Они катализируют образование связей: С - С, С - N, С - О; 6) изомеразы способствуют осуществлению внутримолекулярных превращений. Некоторые из них ускоряют процессы синтеза и распада углеводов. [50]
ДНК-лигазы - ферменты, катализирующие репарацию одноцепочечного разрыва, который обычно возникает под влиянием эндонуклеаз. Поэтому ДНК-лигазы называют еще и сшивающими ферментами. Лигазы обнаружены в самых различных клетках, в том числе и в клетках, зараженных вирусами. Под влиянием этих ферментов образуются фосфодиэфирные связи между свободным 5 -фосфатным концом олиго - или полинуклеотида и З - гидроксильной группой соседнего олиго - или полинуклеотида. Скорее всего реакция протекает с обязательным образованием промежуточного комплекса лигазы с АМФ. Например, в клетках кишечной палочки такой комплекс образуется при взаимодействии лигазы с НАД, а в клетках млекопитающих такой комплекс образуется при взаимодействии лигазы с АТФ. [51]
ДНК-лигазы - ферменты, катализирующие репарацию одноцепочечного разрыва, который обычно возникает под влиянием эндонуклеаз. Поэтому ДНК-лигазы называют еще и сшивающими ферментами. Лигазы обнаружены в самых различных клетках, в том числе и в клетках, зараженных вирусами. Под влиянием этих ферментов образуются фосфодиэфирные связи между свободным 5 -фосфатным концом олиго - или полинуклеотида и З - гидроксильной группой соседнего олиго - или полинуклеотида. Скорее всего реакция протекает с обязательным образованием промежуточного комплекса лигазы с АМФ. Например, в клетках кишечной палочки такой комплекс образуется при взаимодействии лигазы с НАД, а в клетках млекопитающих такой комплекс образуется при взаимодействии лигазы с АТФ. [52]
Синтезируются четыре цепи нуклеотидов, изображенные в верхней части рисунка горизонтальными линиями. Каждая из четырех цепей содержит по 20 нуклеотидов. Цепи построены так, что верхняя правая линия соответствует 20 нуклеотидам ДНК, комплементарным к первым 20 нуклеотидам т - РНК аланина, верхняя левая линия соответствует двадцати следующим. Две нижние горизонтальные линии верхней части рисунка символизируют также отрезки ДНК по 20 нуклеотидов каждый, из них 20 10 нуклеотидов комплементарны к соответствующим 30 нуклеотидам двух верхних цепей. В целом получается жестко связанная 30 парами комплементарных нуклеотидов система четырех цепей ДНК со свободными концами по 10 нуклеотидов в верхней и в нижней цепи. Имеются два разрыва фосфатных связей, отмеченные стрелками. Действием фермента лигазы эти разрывы зашиваются, и на их месте возникают фосфатные мосты. Таким образом, четыре первоначально взятых полинуклеотида превращаются в две цепи, в средней части комплементарно связанные друг с другом. Осталось с помощью полимеразы и набора свободных нуклеотидов комплементарно достроить оба свободных конца молекулы, и двойная спираль из 50 полинуклеотидов готова. Одна из ее цепей комплементарна к 50 первым нуклеотидам т - РНК, другая - комплементарна к первой. [53]
ДНК) состоит из двух компонентов: изучаемого полинуклеотидного фрагмента ( обычно структурного гена) и вектора. В последовательности иуклеоти-дов гена закодирована последовательность аминокислот белка. Однако структурные гены как таковые лишены регуля-торных геиетич. Функциональный компонент рекомбинаитной ДНК-вектор, т.е. специально сконструированная молекула, содержащая регуляторные участки, а именно: начало репликации ДНК, генетич. Большинство векторов получено на основе плазмнд ( небольших кольцевых молекул ДНК бактерий), фагов лямбда и М13, вирусов 8У40 и полиомы ( для животных клеток), плазмиды П из А § гоЪас1епшп ШтеГашем ( для клеток растений), двухмикронной плазмиды пекарских дрожжей. ДНК с помощью определенной рестриктазы или комбинации рестриктаз, соединяют действием лигазы с выбранным вектором и получают кольцевидную рекомбииантиую молекулу ДНК. Ее вводят в клетку-хозяина: это бактерии ( кишечная, сениая палочка и др.), дрожжевые, животные или растит, клетки. Затем проводят селекцию-отбор клеток, содержащих рекомбинантные ДНК, и получают клон, т.е. клетки, однородные по своим генетич. Размножением такого клона можно получить нужное кол-во однородного генетич. [54]