Аффинная лиганда

Cтраница 2

Серьезным ограничением использования аффинной хроматографии в системах с высоким сродством ( напри-мер, гормон-рецептор-ные взаимодействия) и для выделения пико - и наномольных количеств белков является относительно легкое отщепление аффинных лигандов в раствор. Эти аффинные лиганды связаны преимущественно монофункционально с активированной бромцианом сефарозой через пространственную группу. Механизм отщепления аффинных лигандов, связанных с активированной бромцианом сефарозой, в присутствии соединений, содержащих нуклеофиль-ные группы, обсуждался в разд. [16]

Ряд примеров применения иммобилизованных ферментов в аффинной хроматографии приведен в гл. В табл. 11.1 перечислены ферменты, функционирующие как аффинные лиганды при выделении ряда веществ. [17]

В табл. 9.1 указаны цвета, получающиеся при исследовании некоторых производных геля. Увеличение замещения аминопроизводных карбоксильными лиган-дами или гидразидных производных аффинными лигандами, которые содержат аминогруппы, может быть определено по относительной интенсивности окраски геля. [18]

СН-сефарозу 4В, содержащую ковалентно связанную 6-аминогексановую кислоту. К этим носителям с помощью водорастворимых карбодиимидов можно легко присоединить аффинные лиганды через их свободные аминные или карбоксильные группы. Количество связанного 1 6-диаминогексана составляет 6 - 10 мкмоль на 1 мл набухшей АН-сефарозы. Количество связанной 6-аминогексановой кислоты достигает 10 - 14 мкмоль на 1 мл набухшей СН-сефарозы. Гели поставляются в виде лиофилизованных порошков, содержащих в качестве стабилизующих добавок лактозу и декстран. Гели устойчивы в течение 18 мес, если их хранят при 8 С. [19]

Схема фракционирования на волокнах в общем виде. [20]

Вещества, обладающие необходимой специфичностью, такие, как антигены, антитела, лектины и гормоны, либо адсорбируются на этих носителях, либо ковалентно связываются. В табл. 11.1 приведены примеры выделения клеток и используемые для этого аффинные лиганды. [21]

Это, однако, не должно оказывать влияния на специфическое взаимодействие молекулы вещества с молекулой лиганда, например активного центра фермента с иммобилизованным субстратным аналогом. Другой способ уменьшения неспецифичеокой сорбции - предотвратить образование зарядов и гидрофобных участков в иммобилизованных аффинных лигандах ( разд. [22]

Напротив, для выделения антигенов могут быть использованы иммобилизованные антитела. Антигены могут принадлежать к весьма разнообразным типам веществ, и поэтому в табл. 11.1 представлены антитела как аффинные лиганды для выделения очень многих различных соединений. [23]

В микромасштабе он позволяет быстро анализировать смеси белков с избирательным разделением тех компонентов, которые обладают связывающими участками, комплементарными к иммобилизованным специфическим аффинным лигандам. Последние ковалентно связаны с частью матрицы полиакриламидного геля и образуют, таким образом, слой аффинного геля. [24]

Аффинная хроматография представляет собой особый метод, предназначенный для выделения биологически активных соединений. Метод основан на исключительном биологическом свойстве присоединять специфически и обратимо другие вещества, для которых Рейнер и Уэлч [78] ввели название аффиннанты или аффинные лиганды. В настоящее время наиболее расцространенным способом получения нерастворимых аффинных сорбентов является их присоединение к носителю путем образования ковалентных связей. Если раствор, содержащий биологически активное соединение, которое следует выделить, фильтруют через колонку, заполненную нерастворимым носителем, связанным с аффинным лигандом, то все соединения, не обладающие сродством к данному аффинному лиганду, беспрепятственно проходят через колонку, тогда как соединения, обладающие таким сродством, удерживаются в колонке, причем прочность их удерживания зависит от степени их сродства и конкретных экспериментальных условий. [25]

Трудно определить заранее степень, до которой должен быть изменен заряд фермента, чтобы предотвратить его связывание на сорбенте. Максимальное число зарядов на аффинном лиганде, необходимое для предотвращения связывания фермента с ионооб. Поскольку наиболее эффективными аффинными лигандами для элюирования являются те, которые содержат заряженные группы, идентичные заряду ионообменника ( положительно заряженные группы в случае анионообмекников и отрицательные в случае катионообменников), было высказано предположение, что десорбция обусловлена различием в суммарном заряде на свободном ферменте и в заряде комплекса фермент - аффинный лиганд. [26]

Эффективность различных элюирующих систем для десорбции лактат-дегидрогеназы из сердца быка, связанной на колонке ( 40X15 мм с AMP-се. [27]

Как правило, полагали, что при исключении ионных групп из материала матрицы и введении пространственных групп мешающие эффекты могут быть преодолены. Конечно, во многих случаях аффинные лиганды сами имеют ионо-генные свойства и могут связывать, осуществляя ионный обмен. [28]

Для исследования влияния гидрофобных цепей на взаимодействие лактатдегидрогеназы с 8 - ( со-аминоалкил) - производными аде-нозин-5 - фосфата Лоу [1] синтезировал производные, содержащие полиметиленовые пространственные группы разной длины. Как видно из рис. 2, определенные в растворе значения констант инги-бирования ( Ki) лежат в интервале 1 - 6 ммоль / л, достигая максимальной величины для 8 - ( 4-аминобутил) аденозин-5 - фосфата. Для иммобилизованных производных на сефарозе сила взаимодействия между лактатдегидрогеназой и соответствующими иммобилизованными аффинными лигандами, определенная по концентрации NADH, необходимой для вытеснения фермента со специфического сорбента, при увеличении числа метиленовых групп возрастает, что можно объяснить повышающейся доступностью иммобилизованного аффинного лиганда. [29]

Фракционируемый материал может содержать компоненты, которые изменяют активность присоединенного аффинного лиганда. Эти компоненты могут быть близки выделяемым соединениям, хотя это и не обязательно. Ферменты, например протеиназы и нукле-азы, присутствующие в неочищенных экстрактах, могут расщеплять присоединенные аффинные лиганды ( белки, нуклеиновые кислоты) и тем самым уменьшать емкость сорбента для связывания специфически комплементарного соединения. Кроме такой неспецифической деградации аффинного лиганда ферменты и другие химические соединения, присутствующие в фракционируемой смеси, могут специфически модифицировать свойства присоединенного аффинного лиганда, приводя к образованию форм с сохраненной, но измененной активностью. [30]

Страницы: 1 2 3