Аффинная лиганда
Cтраница 3
Лондон, Англия) выпускает полиакриламидные гели под названием энзакрил. Как будет показано ниже, эти акриламидные гели содержат различные функциональные группы, к которым можно присоединять различные аффинные лиганды. [31]
 |
Взаимодействие лактатдегидрогеназы с 8 - ( в-аминоадкил - АМР, содержащей полиметиленовую группировку различной длины. [32] |
На нижнем рисунке для сравнения показана специфическая комплементарная связь выделяемого фермента с иммобилизованным лигандом. При низкой концентрации привязанного аффинанта множественные неспецифические связи не могут реализоваться, поэтому происходит только биоспецифическое связывание молекул фермента по активному центру, если, конечно, образование такой связи стери-чески возможно. Дело в том, что из-за неравномерной поверхности геля, например макросетчатого полимера оксиалкилметакри-латного геля ( рис. 3), связанные через пространственную группу аффинные лиганды делятся на хорошо доступные, менее доступные и стеричеоки недоступные. Пространственные препятствия могут быть одной из причин не только низкого насыщения иммобилизованных молекул аффинанта выделяемым ферментом, но также их гетерогенной аффинности. [33]
Разнообразие условий выделения обусловлено природой выделяемых веществ. Хотя иногда вещество в гомогенном виде выделялось из сырого материала с помощью только хроматографии, значительно чаще встречаются случаи, когда для очистки необходима комбинация аффинной хроматографии с другими методами. Принципы, обязательные для успешной очистки и выделения вещества, в общем виде детально рассмотрены в гл. Для того чтобы читателя информировать об индивидуальных аффинных лигандах, которые были использованы, или о промышленно выпускаемых иммобилизованных аффинных лигандах, во всех случаях приведены коммерческие названия, если они были опубликованы. Эти иммобилизованные лиганды приведены в табл. 11.2, где указаны также их химическая природа и фирма-изготовитель. [34]
 |
Принципы аффинной пертурбации плотности [ 581. [35] |
Принцип фракционирования схематически показан на рис. 7.3. Вначале мембраны физически нарезают на крошечные везикулы. Частицы высокой плотности, с которыми ковалентно связан специфический для выделяемого рецептора аффинный лиганд, добавляются к мембранным фрагментам, несущим данный рецептор. Образующийся между добавленным аффинным лигандом и мембранными частицами комплекс быстро отделяется на ультрацентрифуге, поскольку имеет большую плотность. Для того чтобы избежать трудностей, обусловленных небольшими количествами соответствующих рецепторов, мембраны и аффинные лиганды метят разными радиоактивными изотопами. Образование комплексов между мембранными фрагментами и аффинными частицами может быть блокировано или, если необходимо, исключено путем добавления реагентов с более высоким сродством к аффинному лиганду, чем у данного рецептора, или путем введения избытка аналога рецептора, обладающего близким сродством. [36]
Разнообразие условий выделения обусловлено природой выделяемых веществ. Хотя иногда вещество в гомогенном виде выделялось из сырого материала с помощью только хроматографии, значительно чаще встречаются случаи, когда для очистки необходима комбинация аффинной хроматографии с другими методами. Принципы, обязательные для успешной очистки и выделения вещества, в общем виде детально рассмотрены в гл. Для того чтобы читателя информировать об индивидуальных аффинных лигандах, которые были использованы, или о промышленно выпускаемых иммобилизованных аффинных лигандах, во всех случаях приведены коммерческие названия, если они были опубликованы. Эти иммобилизованные лиганды приведены в табл. 11.2, где указаны также их химическая природа и фирма-изготовитель. [37]
Производные диазония, способные соче-таться с фенольными и гистидиновыми соединениями, были получены з л-аминобензамидоэтил-сефарозы, которая в свою очередь была получена из аминоэтил-сефарозы. Сульфгидрил-агарозу получают из ш-аминоалкилагарозы в результате реакции с тиолактонами гомоцистеина. Аффинные лиганды со свободными карбоксильными группами связывают с сульфгидрил-сефарозой тиолслож-ноэфирными связями с помощью водорастворимых карбодиими дов. [38]
С точки зрения легкости отщепления связывание белков через S - S - мостики, по-видимому, имеет преимущества главным образом при получении иммобилизованных ферментов. Поскольку относительно мало ферментов содержат свободные SH-группы, последние можно ввести Б молекулу тиолированием ( разд. В противоположность этому для сорбентов, приготовленных из стабильных низкомолекулярных соединений, предпочтительнее использовать прочные связи ( например, связывание с эпоксиакхивированными гелями), потому что их активность может быть регенерирована промывкой с денатурирующими реагентами, такими, как 6 М гуанидинхлорид ( разд. Прочная связь образуется также-между альдегидами и аминогруппами, если шиффово основание стабилизировать восстановлением борогидридом натрия. Присоединение аффинных лигандов к носителям, которые содержат активные сложноэфир-ные группы, также ведет к прочной связи. Однако при этом образуются также свободные карбоксильные группы, влияние которых необходимо исключить, что достигается повышением ионной силы раствора при аффинной хроматографии. Причина низкой стабильности заключается, вероятно, в том, что связь образуется не только с фенольным и имидазоль-ным кольцами остатков тирозина и гистидина, но также и с а-концевой и е-аминогруппами. Эти побочные реакции приводят к образованию триазеновых связей ( - N N - NH -), которые менее стабильны и легко гидролизуются. Аффинные лиганды, связанные азосвязью, можно освободить с помощью дитионита натрия. [39]
Страницы: 1 2 3